Gato en spray de calor



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Gato en una placa de poliestireno recubierta por pulverización térmica (Nalgene, Rochester, NY) con una solución 1,5 M de sacarosa en PBS (pH 7,4) a 4 ° C. Al final de la incubación, se eliminó la sacarosa por aspiración, y los espermatozoides se enjuagaron tres veces con PBS y se almacenaron en PBS a 4 ° C durante menos de 2 horas antes de su uso en ensayos * in vitro *.

Ensayo de penetración de esperma {# s2c}

-----------------------

El ensayo de penetración de espermatozoides se realizó como se describió anteriormente [@ pone.0003592-Gupta1], [@ pone.0003592-Gagnon1]. Brevemente, los espermatozoides se diluyeron a 4 x 10 ^ 6 ^ células / ml en PBS que contenía 1 mg / ml de BSA (Sigma-Aldrich) y suero de pollo inactivado por calor al 1%. Para probar los efectos del plasma seminal o del péptido VAP, se incubaron 10 ^ 6 ^ espermatozoides durante 15 min a 37 ° C con 50 o 100 µg de plasma seminal, 1,0 o 2,0 mg / ml de péptido VAP (Sigma-Aldrich). o PBS en presencia o ausencia de 0,5 mg / ml de anti-CD46 (clon 5H10, eBioscience, San Diego, CA). Para evaluar la capacidad del anti-CD46 para bloquear la unión del péptido VAP a los espermatozoides, se incubaron 10 ^ 6 ^ espermatozoides durante 15 min a 37 ° C con 1,0 mg / ml de péptido VAP, en presencia o ausencia de 0,5 mg. / ml de anti-CD46. Para los ensayos para probar el efecto de los anticuerpos o el péptido VAP sobre la exocitosis acrosómica, los espermatozoides se incubaron durante 10 min a 37 ° C en PBS con 1.0 mg / ml de péptido VAP, 10% de suero de ratón o humano (vol / vol, American Cruz Roja, Washington, DC) o 50 µg / ml de cada uno de los anti-CD46 o anti-CD46B (clon KK1.1, proporcionado por el Dr. JL Chappell, Northwestern University) en presencia o ausencia de suero humano normal al 10%. (vol / vol, American Red Cross) para inhibir la actividad del complemento. Los espermatozoides se lavaron con PBS y se incubaron durante 30 min a 37ºC con 3 µM del análogo de cAMP 8-CPT-cAMP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Los espermatozoides se lavaron con PBS, se agitaron con 10 µg / ml de Hoechst 33342 y se determinó el número de células aglomeradas usando un FACScan (Becton-Dickinson, San José, CA). Se contaron al menos 200 células para cada muestra. Los espermatozoides que no se sintieron con Hoechst se consideraron con reacción acrosómica.

En algunos experimentos, los espermatozoides se incubaron primero durante 15 min a 37 ° C con 5 µg / ml de anti-VAP humana de conejo (Biorbyt, San Francisco, CA) o anti-CD46 (clon KK1.1) (eBioscience), 10 % de suero humano normal (vol / vol, Cruz Roja Americana) o 0,5 mg / ml de anti-CD46 o anti-CD46B. Después del lavado, los espermatozoides se incubaron durante 30 min a 37 ° C en PBS conteniendo 3 µM del análogo de AMPc 8-CPT-AMPc (Tecnología de Señalización Celular). Después del lavado, los espermatozoides se agitaron con 10 µg / ml de Hoechst 33342, se lavaron con agn y se incubaron durante 30 min a 37ºC con 3 µM del análogo de AMPc 8-CPT-AMPc. A continuación, las muestras se lavaron con PBS, se resuspendieron en un volumen mínimo de PBS y se colocaron en cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Los cubreobjetos se fijaron en formaldehído al 3,7% en PBS y se montaron en portaobjetos de vidrio. Las muestras se visualizaron mediante microscopía fluorescente y se determinó el número de espermatozoides que reaccionaron con el acrosoma (tratados con Hoechst 33342) utilizando un microscopio Leica (Wetzlar, Alemania) y el software de imágenes MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Para la cuantificación de la motilidad de los espermatozoides, las muestras se diluyeron con medio de Tyrode (pH 7,4) suplementado con glucosa 4,3 mM (Sigma-Aldrich) hasta una concentración de 4 x 10 ^ 6 ^ espermatozoides / ml. A continuación, los espermatozoides se incubaron durante 15 min a 37 ° C en un baño de agua. La motilidad se determinó mediante microscopía de contraste mejorada por video y análisis de video usando el sistema CASA (versión 3.3.1, Hamilton Thorn Research, Beverly, MA). Para algunos ensayos, se incluyó 0,5 mM del análogo de AMPc, impermeable a la membrana, dibutiril-AMPc (Bt-AMPc, Sigma-Aldrich) en el medio de motilidad. A continuación, los espermatozoides se diluyeron en PBS, se incubaron durante 30 min a 37ºC con 3 µM del análogo de AMPc y se determinó la motilidad de los espermatozoides.

Ensayo para el contenido de cAMP de los espermatozoides {# s2d}

-------------------------------

La concentración de AMPc intracelular se midió como se describió previamente [@ pone.0003592-Gupta1], [@ pone.0003592-Gagnon1]. Los espermatozoides se diluyeron a 4 x 10 ^ 6 ^ células / ml en PBS con 1 mg / ml de BSA, y las células se incubaron durante 30 min a 37ºC con 3 mu M del análogo de AMPc 8 - CPT - AMPc. Después de lavar con PBS, los espermatozoides se lisaron con 10 µl de Tris 10 mM (pH 7,4) y se centrifugaron durante 10 min a 4ºC y 14.000 xg. Se recogió el sobrenadante y el intr



Artículo Anterior

Cuidado con el peligro: las serpientes más venenosas de África

Artículo Siguiente

Perro Adoptable de la Semana - Brownie

Video, Sitemap-Video, Sitemap-Videos